1. 非特异性杂交：

- 问题：与目标序列非互补的序列发生杂交，导致背景信号增强。

- 解决方案：增加探针浓度、使用更高浓度的盐溶液抑制非特异性结合，优化杂交条件，并使用更严格的洗涤步骤。

2. 探针降解：

- 问题：探针在使用前或杂交过程中降解，导致信号弱或不稳定。

- 解决方案：确保探针储存和处理过程中的稳定性，使用新鲜制备的探针，避免重复冻融。

3. 组织固定问题：

- 问题：组织固定不当会导致RNA的降解或空间结构改变。

- 解决方案：选择合适的固定剂和固定时间，以平衡组织结构的保存和RNA的保护。

4. 渗透性问题：

- 问题：组织切片的渗透性不佳，导致探针无法有效进入。

- 解决方案：增加组织切片的处理时间，使用蛋白酶K等消化酶处理切片，以改善探针的渗透性。

5. 信号弱或缺失：

- 问题：目标序列浓度低或者探针结合效率低，导致信号弱。

- 解决方案：提高探针浓度，优化杂交和洗涤条件，使用更敏感的检测系统。

6. 探针设计不当：

- 问题：探针与目标序列不完全互补或探针长度不适中。

- 解决方案：重新设计探针，确保高度特异性和适当的长度。

7. 背景染色：

- 问题：切片背景或细胞核非特异性染色，导致信号难以区分。

- 解决方案：使用DNase I处理以减少非特异性染色，优化探针和检测系统的浓度。

8. 洗涤步骤不充分：

- 问题：洗涤不充分导致非特异性的杂交信号残留。

- 解决方案：增加洗涤次数和时间，使用更高浓度的盐溶液。

9. 干燥和干燥不均：

- 问题：切片在实验过程中干燥不均，导致背景染色或信号不均一。

- 解决方案：确保切片在湿润状态下操作，使用防潮盖或湿润室。

10. 设备问题：

- 问题：杂交箱或洗涤设备的不均匀性导致实验条件不一致。

- 解决方案：确保设备正常工作，定期维护和校准。

11. 操作失误：

- 问题：实验过程中的操作错误，如探针滴加不均匀、切片放置不当等。

- 解决方案：严格遵循标准操作流程，进行详细的实验记录。

12. 细胞或组织损伤：

- 问题：切片制备过程中的物理或化学损伤导致RNA的降解。

- 解决方案：使用精细的工具和温和的处理条件来减少损伤。