1. 低效的免疫共沉淀结果:
- 可能原因:抗体亲和力低、蛋白质未能充分表达或表达量少。
- 解决方案:更换高亲和力的抗体,增加目标蛋白表达量或优化转染和细胞裂解条件。
2. 非特异性背景:
- 可能原因:抗体特异性差或裂解过程中蛋白质过度降解。
- 解决方案:增加抗体特异性,优化裂解条件和时间,使用蛋白酶 。
3. 未检测到相互作用蛋白:
- 可能原因:相互作用不稳定、裂解条件过于温和或过强、目标蛋白丰度低。
- 解决方案:优化裂解条件,使用温和的裂解液,预冷裂解条件,提高目标蛋白的表达量。
4. 抗体或蛋白质聚集:
- 可能原因:裂解液中的盐浓度或pH值不适宜,抗体或蛋白质本身易聚集。
- 解决方案:调整裂解液的盐浓度和pH值。
5. 非靶标蛋白的共沉淀:
- 可能原因:抗体交叉反应、裂解过程中蛋白质过度释放。
- 解决方案:使用高度特异性的抗体,优化裂解条件,减少非特异性相互作用。
6. 沉淀效率低:
- 可能原因:沉淀材料(如蛋白A/G珠子)未充分孵育,沉淀材料的质量差。
- 解决方案:确保抗体和沉淀材料有充分的孵育时间,更换高质量的沉淀材料。
7. 目标蛋白过表达造成饱和:
- 可能原因:目标蛋白的过量表达可能会使内源性相互作用饱和。
- 解决方案:减少目标蛋白的表达量,或使用更灵敏的检测方法以识别内源性水平的相互作用。
8. 实验重复性差:
- 可能原因:操作条件不一致、实验材料批次差异等。
- 解决方案:严格标准化实验操作流程,使用相同批次的材料进行重复实验。
9. 细胞裂解不彻底:
- 可能原因:裂解液的选择不适合目标蛋白或裂解时间不够。
- 解决方案:使用更加有效的裂解液或延长裂解时间。
10. 免疫共沉淀结果的解释困难:
- 可能原因:实验结果可能受多种因素影响,导致结果解释困难。
- 解决方案:结合其他实验技术(比如酵母双杂交、荧光共振能量转移等)来验证结果。