生物透射电子显微镜TEM
仪器型号: Hitachi HT7700,Hitachi HT7800,JEM1400 等
送样方式:
可接收固定好的细胞/组织样品并附有详细送检要求的送样单。
①需要您提供的样品:收集细胞/组织取样(新鲜迅速取材),置于1.5ml离心管内,加入2.5%的戊二醛溶液(固定液加满离心管,使样品完全浸没在固定液中),可放置于4°C保存,请不要倒弃固定液,一般固定12h后可寄送(务必采用1.5ml离心管寄送)。
②打印填写完整的预约单、送样单和样品一起寄送。
具体取材及固定方法如下:
1. 对于细胞类,106以上的细胞,用细胞刮刀刮下来(不要反复刮取,动作迅速一次性刮取下来),1500-3000转离心,5-10min,收集细胞于管底肉眼可见2-3粒大米状样品,如果细胞量很多,把细胞团块用细针尖挑成几个小团块,弃上清,沿管壁缓慢加入4℃预冷的固定液,然后放入4°C冰箱保存。
2. 对于组织类,新鲜取材,取材位置准确,组织大小尽量在1-2mm³,离体取材后请立即投入4℃预冷的固定液中,然后放入4°C冰箱固定保存(对于无法下沉的样品,一定要通过抽真空,让样品沉下去)。
3. 对于细菌类,吸取OD0.5-0.8的培养物,离心后弃培养基,收集菌体沉淀于管底黄豆大小,可以用PBS洗1-2次,弃掉上清液,沿管壁缓慢加入4℃预冷的固定液,然后放入4°C冰箱保存(固体培养的标本取样时尽可能把培养基削薄一点,块切小)。
该方法是常用方法,不一定适用所有样品,建议查阅文献选择最合适的方法!
*固定液的量请参考上图,加至箭头所示位置
下列操作由我们完成:
倒掉固定液,用0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;用1%的锇酸溶液固定样品1-2h;小心取出锇酸废液,用0.1M,pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min;用梯度浓度(包括30%,50%,70%,80%,90%和95%五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理,每种浓度处理15min,再用100%的乙醇处理20min;最后过度到纯丙酮处理20min。用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=1/1)处理样品1h;用包埋剂与丙酮的混合液(V/V=3/1)处理样品3h;纯包埋剂处理样品过夜;将经过渗透处理的样品包埋起来,70℃加热过夜,即得到包埋好的样品。样品在超薄切片机中切片,获得70-90nm的切片,切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5-10min,晾干后即可在透射电镜中观察。
1. 2.5%戊二醛固定液如何配置?
市售25%戊二醛水溶液 10ml
0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0) 50ml
蒸馏水加至 100ml
2. 0.2M,pH7.0磷酸缓冲液的配置方法?
A液:Na2HPO4·H2O 31.61g,或者Na2HPO4·7H2O 53.63g,或者Na2HPO4·12H2O 71.64g,加蒸馏水至1000ml
B液:NaH2PO4·H2O 27.6g,或者NaH2PO4·2H2O 31.21g,加蒸馏水至1000ml
0.2M,pH7.0磷酸缓冲液= A液61ml+B液39ml(合起来是100ml)
3、植物的根部为什么有时看不到细胞核?
植物细胞的细胞核相对比较小,不好切,切片的时候有可能没有切到,所以在观察透射电镜的时候会发现看不到细胞核。
4、切片染色的目的是什么?
由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子的散射能力很弱,相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋,这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物样品超薄切片观察时像的反差极弱。为了提高图像的反差,要对超薄切片进行电子染色。这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色,它是利用重金属盐(如铅盐、铀盐等)与细胞的某些成分或结构结合,由于重金属对电子散射能力很强,使那些与其结合的结构或成份对电子散射能力增强,从而达到提高样品本身反差的。目前最常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。